Long Li csoportja a Pekingi Egyetem Élettudományi Iskolájában publikált egy tanulmányt a Nature Structural & Molecular Biology folyóiratban "A mitokondriális preproteinimport molekuláris útja a TOM-TIM23 szuperkomplexen keresztüli mitokondriális preproteinimport molekuláris útvonalán keresztül". A tanulmány a mitokondriális fehérjetranszportot közvetítő TOM-TIM23 szuperkomplex szerkezeti és biokémiai eredményeiről számol be, feltárja a fehérjeimport új útvonalát a TOM komplexen keresztül a mitokondriális külső membránon keresztül, és újradefiniálja a belső TIM23 transzporter komplexum magösszetételét. mitokondriális membrán.
Az eukarióta sejtek egyik legfontosabb organellumjaként a mitokondriumok fontos szerepet játszanak az energiaellátásban, az intracelluláris anyagcserében, a homeosztázisban és az apoptózisban. A mitokondriumok egyedi belső és külső kettős rétegű lipidmembrán szerkezettel rendelkeznek, és több mint 1,000 fehérje oszlik el benne. A mitokondriális fehérjék 99%-át citoszolikus gének kódolják, a citoplazmában lévő riboszómákban szintetizálódnak, és a membránon keresztül a mitokondriumokba szállítják funkciójukat. Ezért a mitokondriális fehérjék szállítása kritikus fontosságú a mitokondriális aktivitás fenntartása és szabályozása szempontjából, és a kapcsolódó gének mutációi szorosan összefüggenek számos anyagcsere-betegség és rák kialakulásával az emberben. Li Long csoportja azon molekuláris mechanizmusok feltárásán dolgozik, amelyek révén a mitokondriális fehérjék bejutnak a mitokondriumokba, és a publikált munkák során feltárták azt az utat, amelyen keresztül a mitokondriális membránfehérjék a TIM22 transzportkomplexen keresztül jutnak be a belső membránba (Zhang Y. et al. Cell Research 2021). A TOM-TIM23 szuperkomplex szerepe a mitokondriális fehérjetranszportban még fontosabb ebben a tanulmányban. Ez a több tucat fehérje alegységből összeállított szuperkomplex átfogja a belső és külső mitokondriális kettősrétegű membránokat, és több mint 500 mitokondriális oldható és membránfehérje szállítását szabályozza. Az elmúlt 40 évben a kutatók alaposan és intenzíven tanulmányozták a TOM és a TIM23 transzportkomplexum egyes alegységeit. Ennek a szuperkomplexnek a rendkívül dinamikus természete miatt azonban még mindig nagyon korlátozott annak a központi kérdésnek a megértése, hogy ezek az alegységek hogyan épülnek fel a fehérjetranszport útvonal kialakítására, különösen az endoszómális membránban található TIM23 komplex esetében, ahol a mag összetétele. a szállítási egység nagyon homályos.
Ebben a tanulmányban a szerzők először egy stabil TOM-TIM23 szuperkomplex összeállításával kezdték, különféle összeállítási sémákat vizsgáltak meg, végül a zöld fluoreszcens fehérje és a mitokondriális fehérje, mint transzport szubsztrát fuzionálása mellett döntöttek, és megörökítették a TOM-TIM23 köztes állapotát. szuperkomplex fehérjeszubsztrátok szállítására élesztősejtekben. In vitro tisztítás után ez a köztes állapot még stabilizálható volt további szerkezetbiológiai és biokémiai vizsgálatokhoz. Ennek a köztes állapotnak a krio-elektronmikroszkópos egyrészecskés elemzésével a szerzők azt találták, hogy közvetlen kölcsönhatás van a külső membránban található TOM komplex és a belső membránban található TIM23 komplex között, amely összeköti a belső és külső mitokondriális membránokat. , amely hatékonyan szállítja a fehérje szubsztrátot a külső mitokondriális membránból a belső membránba (1a. ábra). Különösen a TOM komplexet 4,1 Å felbontásra oldották fel. A szerkezet feltárt egy "poláris aminosav útvonalat" a Tom40 csatorna alegységének belső falában, amely a fajokon át konzervált, és közvetíti a fehérje szubsztrát áthaladását a Tom40 közbenső póruson kibontott formában (1b. ábra). Ez az útvonal különbözik a Tom40-ben korábban biokémiai kísérletek alapján javasolt két transzmembrán útvonaltól, amely bemutatja a TOM komplex sokoldalúságát a különböző mitokondriális fehérjék hatékony felismerésében és szállításában.
1. ábra. A TOM-TIM23 szuperkomplex felépítése. (a) A TOM-TIM23 szuperkomplex sematikus összeállítása és krio-elektronmikroszkópos szerkezete. (b) A fehérjeszubsztrátot tartalmazó TOM komplex krio-elektronmikroszkópos szerkezeti modellje. (c) A Tim17-Tim23-Mgr2 heterotrimer AlphaFold2 szerkezeti modellje
Ezenkívül a szerzők szisztematikusan nem természetes aminosavakat juttattak be a fehérjeszubsztrát különböző helyeire, és fotocrosslinking segítségével megvizsgálták a fehérje szubsztrát környezetét a TOM-TIM23 transzportútvonalában, így azonosították azt a mag alegységet, amely közvetlenül segíti a szubsztrát átjutását két lipid membrán. A kísérleti eredmények azt mutatták, hogy a fehérje szubsztrát C-terminális fragmense keresztkötődhet a külső membrán Tom40 alegységével, ami összhangban van a szerkezeti megfigyelésekkel. Meglepő módon azonban a fehérje szubsztrát N-terminális fragmense a belső membránban a Tim17 és Mgr2 alegységekkel keresztkötést köt, de nem a Tim23 alegységhez, amelyet általában a belső membrán transzportcsatornaként azonosítanak. Ez az eredmény azt sugallja, hogy a korábbi tanulmányok során jelentős torzítás lehet a TIM23 komplexum alapvető szállítási útvonalának észlelésében. A TIM23 mag transzporter alegységeinek és útvonalainak további azonosítására a szerzők az AlphaFold2 modellezés, a biokémiai keresztkötések, az élesztőgenetika és a mitokondriális fehérjék in vitro transzportjának kombinációját alkalmazták, és megállapították, hogy a TIM23 komplex központi komponense egy heterotrimer. Tim23, Tim17 és Mgr2 alegységekből áll, a Tim17 és Mgr2 szemtől-szembe egy csatornaszerű struktúrát alkot, míg a Tim23 egymás melletti formában kötődik a Tim17-hez, és nem vesz részt a csatornaképzésben (1c. ábra). ). A fehérjetranszlokáció során a fehérjeszubsztrát áthalad a Tim17 és Mgr2 által kialakított csatornaszerű struktúrán, és nem érintkezik közvetlenül a Tim23 alegységgel. A mutagenezis kísérletek kimutatták, hogy az Mgr2 leütése élesztőben nem befolyásolta a fehérje transzlokációt, ami arra utal, hogy a Tim17 és az Mgr2 által alkotott csatornaszerű struktúrában csak Tim17 szükséges. A Tim17 annak az oka, hogy a Tim17 segítheti a fehérjéket az endoszómális membránon való átjutáshoz felszíni aminosav eloszlás: egyrészt a Tim17-nek van egy erősen konzervált negatív töltésű régiója az endoszomális membrán bejáratánál, amely megzavarhatja a lokalizált Egyrészt a Tim17-nek van egy erősen konzervált negatív töltésű régiója a belső membrán bejáratánál , amely megzavarhatja a helyi foszfolipid kettős réteg szerkezetét, és csökkentheti a fehérjék lipidmembránon való átjutásának energiagátját; másrészt a Tim17 konzervált hidrofób régióval rendelkezik az útvonal közepén, amely segít a mitokondrium belső membránjának légmentesen tartásában és a mitokondriális fiziológiai aktivitásokhoz szükséges membránpotenciál fenntartásában. Különböző szerkezeti és biokémiai kísérletek eredményeit összesítve megállapítható, hogy a Tim17 alegységet magába foglaló TIM23 komplex kevert módot alkalmaz a fehérje transzlokáció elősegítésére, azaz a Tim17 vagy dinamikusan kapcsolódhat más alegységekhez, hogy létrehozzon egy alegységet. csatorna segíti át a fehérjéket a membránon, vagy a Tim17 az inszerciós enzim munkamódjában dolgozik, hogy egyedül hajtsa végre a fehérje transzlokációját, anélkül, hogy csatornaképzésre lenne szükség. Ez az eredmény kiigazítja azt a félreértést, amely az elmúlt 40 évben a területen kialakult, miszerint a Tim23 alegység központi csatornát jelent.
Összefoglalva, ez a tanulmány egy új stratégiát dolgozott ki a fehérjetranszport vizsgálatokhoz, feltárta a mitokondriális fehérjék kritikus útvonalát a kétrétegű lipidmembránon a TOM-TIM23 szuperkomplexen keresztül történő átjutásához (2. ábra), megdöntötte a régóta fennálló terepi ismereteket a fehérjetranszport-vizsgálatokhoz. a belső membrán TIM23 transzport komplexumát, és felfedezte a fehérjetranszport enzim működésének egy teljesen új módját, amely szilárd alapot teremt a mitokondriális bioszintézis átfogó és elmélyült megértéséhez. szintézis, szilárd alapot teremtve a mitokondriális bioszintézis átfogó és mélyreható megértéséhez.
2. ábra: mitokondriális TOM-TIM23 transzporter útvonal
Long Li a cikk megfelelő szerzője, Xueyin Zhou, a Peking Egyetem-Tsinghua Közös Élettudományi Központ PhD-hallgatója 2018-ban, Yuqi Yang, a School of Life Sciences 2019-es osztályának PhD-hallgatója, Dr. Peng Wang, a Pekingi Egyetem krio-elektronmikroszkópos platformjáról, és Shanshan Wang, a School of Life Sciences 2020-as osztályának PhD-hallgatója az első társszerzők. Dongjie Sun, egykori technikus Li Long laboratóriumában, Xiaomin Ou, a College of Life Sciences 2022-es osztályának PhD-hallgatója és Yuke Lian, a College of Life Sciences 2021-es osztályának PhD-hallgatója jelentős mértékben hozzájárult a ezt a kutatást. Ning Gao professzor és Ningning Li társkutató a Pekingi Egyetem Élettudományi Iskolától, valamint Xinzheng Zhang kutató a Kínai Tudományos Akadémia Biofizikai Intézetétől nagy segítséget nyújtott a krio-elektronmikroszkópos adatok kiszámításához, valamint Prof. Qing Li és Prof. Gain Chang a Pekingi Egyetem Élettudományi Karától fontos útmutatást adott az élesztőgenetikával és a fotocrosslinking kísérletekkel kapcsolatban. A kutatási munkát a Pekingi Egyetem krioelektronmikroszkópos platformja, a High Performance Computing Center, az Institute of Life Sciences Instrumentation Centere és a National Phoenix Protein Platform támogatta, és a Pekingi Egyetem-Tsinghua Közös Központ Membránbiológiai Állami Kulcslaboratóriuma finanszírozta. az Élettudományokért és a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítványért.
